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                ELISA方法測定單克隆抗體實驗原理及操作步驟

                更新時間:2024-03-18      瀏覽次數:12

                ELISA方法測定單克隆抗體實驗原理及操作步驟
                一、實驗目的
                1. 深入了解ELISA法測定抗體效價的原理。
                2. 掌握ELISA法測定單克隆抗體效價的方法。
                二、實驗原理
                ELISA是以免疫學反應為基礎,將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的gao效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。免疫酶技術是將酶標記在抗體/抗原分子
                上,形成酶標抗體/酶標抗原,稱為酶結合物。該酶結合物的酶在免疫反應后,作用于底物使之呈色,根據顏色的有無和深淺,定位或定量抗原/抗體。ELISA 法是免疫酶技術的一
                種,其特點是利用聚苯乙烯微量反應板(或球)吸附抗原/抗體,使之固相化,免疫反應和酶促反應都在其中進行。在每次反應后都要反復洗滌,這既包證了反應的定量關系,也
                避免了末反應的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA法中。 酶促反應只進行一次, 而抗原/抗體的免疫反應可進行一次或數次, 即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進行免疫反應。
                目常用的幾種ELISA方法有:測定抗體的間接法,測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價。其主要過程為:先將已知定量抗
                原吸附在聚苯乙烯微量反應板的凹孔內,加待測抗體,保溫后洗滌以除去未結合的雜蛋白質,加酶標抗抗體,保溫后洗滌,加底物保溫30分鐘后,加酸或堿終止酶促反應,用目

                測或光電比色測定抗體含量。


                三、儀器、原料和試劑
                1.儀器
                (1.1)聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯免疫閱讀儀、水浴鍋。
                2.原料
                (2.1)單克隆抗體
                3.試劑
                (3.1)抗原及酶標記抗體
                (3.2)抗原:兔抗人lgG(Rabbit Aanti-human lgG, Code No. A0423);
                (3.3)酶標抗抗體:兔抗鼠lgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP, Code No. P0260);使用時按照說明書要求稀釋。
                4.洗滌液(含0.05% Tween 20的PBS): 1LPBS 中加入Tween-20 500μ L.
                5.封閉液(含1%牛血清白蛋白,0.1% Tween 20的PBS): 10mLPBS 中加入100mgBSA, 10 μ LTween-20.
                6.底物溶液
                (6.1)磷酸-鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0):稱Na2HPO4 .12H2O2.2g,NaH2PO4 . 2H2O 6.84g,用蒸餾水溶解,定容至500mL.
                  (6.2) TMB貯液:稱60mgTMB 溶于10mL二甲基亞砜中,4℃避光保存。
                (6.3)底物應用液:現用現配,磷酸鈉緩沖液10ml, TNB 貯液10μ L.30% H2O2 15μL,混勻。
                7.終止液: 2mol/LH2S04
                四、操作步驟
                1、抗原包被:兔抗人lgG作為抗原,用包被液1: 8000稀釋,100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板中。4℃放置過夜。
                2、洗滌:次日傾去凹孔內的液體,洗滌液洗3次。
                3、封閉:加100μ L/孔封閉液,室溫放置0.5h.
                4、洗滌:用洗滌液洗3次。
                5、加待測樣品(一抗): 將含單克降抗體的細胞培養上清在另塊板上用PBS連續稀釋(按照1: 2或1: 10), 100μ L /孔加到已包被的板上,每個樣品平行做兩份,PBS 或空白培養
                基作為陰性對照,已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h.
                6、洗滌:用洗滌液洗3次。
                7、加酶標抗抗體:兔抗鼠IgG-HRP, 用封閉液1: 8000稀釋,100μL/孔, 加蓋37℃恒溫箱溫育1h.
                8、洗滌:用洗滌液洗5次,蒸餾水洗2次。
                9、顯色:加新鮮配制的底物溶液100μL孔,室溫暗處放置5~30min,顯示藍色。
                10、終止反應、比色。加50μL/孔終止液。顏色變黃:用酶標儀測定450nm
                處各孔的吸光值, 陽性反應的蕞大稀釋度為待測樣品的效價。


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