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                丙酮酸脫羧酶(PDC ) 活性測定試劑盒說明書 紫外分光光度法

                更新時間:2024-02-18      瀏覽次數:109

                                                                                規格:50管/48樣

                丙酮酸脫羧酶( pyruvate decarboxylase,PDC )活性測定試劑盒說明書

                紫外分光光度法

                注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

                測定意義:

                PDC主要存在于酵母中,是乙醇發酵的關鍵酶之一,催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

                測定原理:

                PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛,添加乙醇脫氫酶(ADH)來進一步催化 NADH還原乙醛生

                成乙醇和NAD+;NADH在340nm有吸收峰,而NAD+沒有;通過測定340 nm光吸收下降速率,來計算PDC活性。

                自備儀器和用品:

                研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、可調式移液槍和蒸餾水。

                試劑組成和配制:

                試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。

                試劑二:液體×1 瓶,4℃保存。

                試劑三:液體×1 瓶,4℃保存。

                試劑四:粉劑×1 瓶,﹣20℃保存。

                試劑五:液體×1 瓶,﹣20℃保存。

                混合試劑:臨用前配制,小心把試劑四和五轉移到試劑三中,充分溶解。

                試劑六:液體×1 瓶,4℃保存。

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                1、細菌或細胞處理:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照每200萬細菌或細胞加入400μL試劑一,超聲波破碎細菌或細胞(功率200W,工作3s,間歇10s,工作35次),16000g 4℃離心20min,取上清,置冰上待測。

                2、組織處理:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組

                織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿,16000g 4℃離心 20min,取上清,置冰上待測。

                3、血清(漿)等液體樣品:直接檢測。

                PDC 測定操作:

                1. 分光光度計預熱30min,調節波長到340 nm,蒸餾水調零。

                2. 試劑二置于25℃水浴中預熱30min。

                3. 空白管:依次在 1mL 石英比色皿中加入100μL蒸餾水、100μL混合試劑、700μL試劑二

                和100μL試劑六,迅速混勻后于340nm比色,記錄15s和75s的吸光值,分別記為 A1 和A2。

                4. 測定管:依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、100μL混合試劑、700μL試劑二

                和100μL試劑六,迅速混勻后于340nm 比色,記錄15s和75s的吸光值,分別記為A3和A4。

                注意:空白管只需測定一次。

                PDC 活性計算公式:

                (1)按照蛋白濃度計算

                活性單位定義:25℃中,每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol NADH 氧化為 1 個酶活單位。

                PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×106 }÷(Cpr×V 樣) ÷T

                =1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷Cpr

                (2)按照樣本質量計算

                活性單位定義:25℃中,每克組織每分鐘催化 1μmol NADH 氧化為 1 個酶活單位。

                PDC (μmol/min/g) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×106 }÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

                =1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷W

                (3)按細胞數量計算

                活性單位定義:25℃中,每104個細胞每分鐘催化1μmol NADH 氧化為 1 個酶活單位。

                PDC (μmol/min/104 cell) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×106 }÷(細胞數量×V 樣÷V 樣總)÷T=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷細胞數量

                (4)按血清(漿)體積計算

                活性單位定義:25℃中,每毫升血清(漿)每分鐘催化1μmolNADH 氧化為1個酶活單位。

                PDC (μmol/min /mL) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×106 }÷V 樣÷T

                =1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]

                 

                ε:NADH 摩爾消光系數,6.22×10 3 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 總:反應體系總體

                積,1mL=0.001L,V 樣:加入反應體系中上清液體積,0.1mL;Cpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量試劑盒;W:樣本質量,g ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,1 min。

                 

                注意事項:

                配制好的混合液 3 天內使用完。


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